Dulu tak kira kalau PCR tuh pasti loh komposisinya pasti denaturasi nya 1 menit, annealingnya 1 menit dan ekstensinya 2 menit. Hal itu dikarenakan memang komposisi yang tepat untuk pemisahan untai ganda yang ada trus dilanjutkan dengan penempelan primer yang dimaksud trus pemanjangan primer tersebut harus 1 : 1 : 2, ternyata itu salah besar toh.....Jangan pernah optimasi PCR dengan memulai dengan komposisi seperti itu. Kalau kita bicara tentang PCR, tentunya kita bicara tentang lima hal sekaligus yaitu 1. tentang sequen DNA yang kita miliki, 2. primer yang akan kita gunakan, 3. mix PCR yang kita pilih, 4. suhu denaturasi dan 5. suhu anneallingnya.
Tentang DNA yang kita miliki kita harus paham benar tentang hal tersebut, apakah DNA kita telah kita murnikan sehingga kita tidak akan mendapatkan pita-pita yang tidak jelas, ataukah tanpa kita murnikan. Selain itu, kita juga harus tau berapa nih besaran konsentrasi DNA kita, memang sih untuk PCR biasanya konsentrasinya berkisar antara 20-50 ng akan tetapi pernah saya membuat suatu metode PCR berhasil dengan konsentrasi DNA hanya berkisar 0,2-0,4 ng, nah loe....jadi pada titik ini memang perlu dilakukan variasi sehingga kita temukan titik optimumnya.
Kalau primer yang terpenting adalah membaca literatur sih, dan tentukan juga konsentrasi yang kita pakai, kalau terlalu banyak akan dijawab dengan penampakan ekses primer dibawah gel hasil elektroforesis. Biasanya kita gunakan untuk PCR adalah sekitar 100-500 ng, ini juga ditentukan oleh lamanya annealling yang dilakukan, semakin lama maka semakin banyak primer yang dibutuhkan.
Mix PCR ini jelas akan mengacu pada literatur tapi yang perlu digarisbawahi disini adalah penggunaan dNTP yang ada, apakah dengan waktu ekstensi yang ada bisa dicover oleh dNTP yang tersedia, sebab bila tidak maka untai DNA ini akan menjawab dengan membuat spin pada basa-basa yang cocok, hal ini akan mengakibatkan DNA terplintir dan terpotong-potong pada siklus berikutnya.
Untuk suhu denaturasi dan annealling perlu disisir dari suhu 30 tiap dua derajat naik ke atas, kalau RAPD ya sampai 40 itu udah maksimal, kalau sampai suhu tersebut belum ditemukan maka bisa dikatakan bahwa unsur lain yang mempengaruhi hal tersebut, bukan suhunya.
Setelah itu kembali ke waktu tiap-tiap tahap dalam PCR ini, tentunya kita gak mau kan kalau PCR kita habis bahannya ditengah jalan, soalnya gak bisa diisi ulang ditengah reaksi sih. Untuk itu perhitungkan dengan matang sebab dalam waktu 1 menit itu Taq polymerase bisa bekerja dalam 2000 kopi basa-basa yang ada (termasuk eksistensinya = pemanjangan), nah kita bisa hitung dengan tangan, apakah dNTP kita mencukupi untuk sekian siklus atau habis di tengah-tengah siklus yang kita rencanakan.
Gimana sih kalau habis dNTP nya ditengah reaksi, ya untai DNA itu akan berpilin karena memang dalam posisi single stranded karena adanya proses denaturasi. Pada saat annealling, ada dua untai yang saling komplement dan terdapat pilinannya, saat inilah yang menentukan, ketika pemanjangan (elongasi) maka untai tersebut akan terhenti atau bahkan terputus. Hal inilah yang menyebabkan DNA terfragmentasi menjadi kecil-kecil dan terlihat seperti ekses primer pada elektroforesis.
dong ra, kalau gak dong boleh nanya kok ?
Tentang DNA yang kita miliki kita harus paham benar tentang hal tersebut, apakah DNA kita telah kita murnikan sehingga kita tidak akan mendapatkan pita-pita yang tidak jelas, ataukah tanpa kita murnikan. Selain itu, kita juga harus tau berapa nih besaran konsentrasi DNA kita, memang sih untuk PCR biasanya konsentrasinya berkisar antara 20-50 ng akan tetapi pernah saya membuat suatu metode PCR berhasil dengan konsentrasi DNA hanya berkisar 0,2-0,4 ng, nah loe....jadi pada titik ini memang perlu dilakukan variasi sehingga kita temukan titik optimumnya.
Kalau primer yang terpenting adalah membaca literatur sih, dan tentukan juga konsentrasi yang kita pakai, kalau terlalu banyak akan dijawab dengan penampakan ekses primer dibawah gel hasil elektroforesis. Biasanya kita gunakan untuk PCR adalah sekitar 100-500 ng, ini juga ditentukan oleh lamanya annealling yang dilakukan, semakin lama maka semakin banyak primer yang dibutuhkan.
Mix PCR ini jelas akan mengacu pada literatur tapi yang perlu digarisbawahi disini adalah penggunaan dNTP yang ada, apakah dengan waktu ekstensi yang ada bisa dicover oleh dNTP yang tersedia, sebab bila tidak maka untai DNA ini akan menjawab dengan membuat spin pada basa-basa yang cocok, hal ini akan mengakibatkan DNA terplintir dan terpotong-potong pada siklus berikutnya.
Untuk suhu denaturasi dan annealling perlu disisir dari suhu 30 tiap dua derajat naik ke atas, kalau RAPD ya sampai 40 itu udah maksimal, kalau sampai suhu tersebut belum ditemukan maka bisa dikatakan bahwa unsur lain yang mempengaruhi hal tersebut, bukan suhunya.
Setelah itu kembali ke waktu tiap-tiap tahap dalam PCR ini, tentunya kita gak mau kan kalau PCR kita habis bahannya ditengah jalan, soalnya gak bisa diisi ulang ditengah reaksi sih. Untuk itu perhitungkan dengan matang sebab dalam waktu 1 menit itu Taq polymerase bisa bekerja dalam 2000 kopi basa-basa yang ada (termasuk eksistensinya = pemanjangan), nah kita bisa hitung dengan tangan, apakah dNTP kita mencukupi untuk sekian siklus atau habis di tengah-tengah siklus yang kita rencanakan.
Gimana sih kalau habis dNTP nya ditengah reaksi, ya untai DNA itu akan berpilin karena memang dalam posisi single stranded karena adanya proses denaturasi. Pada saat annealling, ada dua untai yang saling komplement dan terdapat pilinannya, saat inilah yang menentukan, ketika pemanjangan (elongasi) maka untai tersebut akan terhenti atau bahkan terputus. Hal inilah yang menyebabkan DNA terfragmentasi menjadi kecil-kecil dan terlihat seperti ekses primer pada elektroforesis.
dong ra, kalau gak dong boleh nanya kok ?
Tidak ada komentar:
Posting Komentar